Разрешающая способность микроскопа характеризуется величиной, обратной линейному пределу разрешения. Согласно дифракционной теории Аббе линейный предел разрешения микроскопа, т. е. минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, определяется по формуле
где линейный предел разрешения; длина волны света, в котором проводится наблюдение; А - числовая апертура, или просто апертура, микроскопа (микрообъектива).
Из формулы (324) следует, что для повышения разрешающей способности микроскопа нужно уменьшать длину волны света и увеличивать числовую апертуру микроскопа. Первая возможность реализуется путем фотографирования исследуемых предметов в ультрафиолетовом излучении.
Апертура микроскопа определяется по формуле где Значение апертурного угла современных высококачественных микрообъективов доведено практически до предела.
Другая возможность увеличения апертуры - применение иммерсионной жидкости, помещаемой между рассматриваемым предметом и микрообъективом. В качестве такой жидкости используют воду кедровое масло монобромнафталин
Чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, определяемую по формуле (324), необходимо иметь соответствующее видимое увеличение. Если две точки передней фокальной плоскости оптической системы расположены друг от друга на линейном расстоянии (рис. 157), то
Рис. 157. Схема для определения полезного увеличения микроскопа
угловое расстояние между этими точками в пространстве изображений
Глаз наблюдателя будет воспринимать эти точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза
Из формул (325), (324) и (317) следует, что видимое увеличение микроскопа
По последней формуле можно определить минимальное видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа. Это увеличение называется полезным. При использовании формулы (326) следует иметь в виду, что во многих случаях диаметр выходного зрачка микроскопа составляет Это приводит к увеличению углового предела разрешения глаза до Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра то при угловом пределе разрешения глаза согласно (326) для полезного увеличения микроскопа получим.
Согласно определению английского физика Рэлея разрешение оптической системы естьминимальное расстояние между двумя точками формируемого ею изображения,пока они еще видны раздельно . Рэлей показал, что максимальное разрешение линзы (т.е. минимальное расстояние d между двумя соседними точками изображения) прямо пропорционально длине используемой световой волны l и обратно пропорционально показателю преломления среды n , а также углу раскрытия a :
Длина волны l равна произведению скорости света v на период колебаний T . Показатель преломления n определяется как отношение скорости света в вакууме (300000 км/сек) к скорости света v в данной среде. Для воздуха показатель преломления равен 1.0, для воды - 1.3, для кедрового масла - 1.5. Угол раскрытия a характеризует способность линзы собирать световые лучи. Он определяется как угол между двумя линиями, соединяющими край линзы с точкой ее переднего фокуса и, следовательно, зависит от диаметра линзы и ее кривизны (рис. 3). Максимальное значение a для современных объективов достигает 138 о.
Рис. 3. Угол раскрытия объектива a
Из формулы Рэлея также следует, что разрешение микроскопа можно повысить тремя способами:
1) уменьшением длины волны l (этот способ реализован в ультрафиолетовом и электронном микроскопах);
2) повышением показателя преломления среды n (иммерсионные объективы);
3) увеличением диаметра линз объектива (т.е увеличением угла a ).
Для того чтобы было удобно сравнивать разрешение различных объективов, Аббе выделил знаменатель формулы Рэлея в отдельный показатель - численную апертуру NA
, после чего формула приняла следующий вид:
Численная апертура объектива NA = n * sin(a/2)
характеризует его разрешающую способность вне зависимости от конструкции и применяемой длины волны. Введение усредняющего коэффициента 0.61 отражает тот факт, что максимальное разрешение обеспечивают только краевые лучи с максимальным углом a
, тогда как близкие к центральному лучи дают разрешение в два раза ниже (рис 3). NA воздушных объективов всегда меньше 1
(n
= 1, sin a
< 1), но иммерсионные объективы могут иметь NA и больше 1. Величина численной апертуры объектива гравируется на его корпусе, что позволяет легко вычислить его номинальное разрешение, используя формулу Рэлея-Аббе. В этих расчетах обычно принимают, что средняя длина волны дневного света составляет 550 нм. Численная апертура современных иммерсионных объективов достигает значений 1.3 – 1.4. Рекорд в этой области принадлежит объективу фирмы Карл Цейсс с апертурой 1.45, который способен формировать изображения микроструктур размером 170 нм.
Кроме разрешения в плоскости препарата d (разрешения по полю), объектив микроскопа обладает также разрешением по глубине dz (Young, 1998).
Особую роль разрешение по глубине (глубина фокуса) играет в конфокальной микроскопии, где на основе оптических срезов создаются трехмерные реконструкции микроструктур и где толщина оптического среза сильно влияет на качество реконструкции. Поэтому в конфокальных микроскопах предусмотрены специальные аппаратные и программные средства, позволяющие уменьшать глубину фокуса. Как следует из формулы Янга для обычного микроскопа глубина фокуса dz почти не отличается от разрешения по полю d.
Вторым по значимости показателем объективов и окуляров является увеличение, которое также всегда указано на их оправе. Как правило, чем выше увеличение объектива, тем больше у него численная апертура (т.е. разрешение). Однако эта зависимость соблюдается не всегда - существуют объективы одного увеличения с разной и даже регулируемой апертурой, а объективы с высокой апертурой могут иметь пониженное увеличение. В связи с этим различают полезное и бесполезное увеличение , имея ввиду, что полезное увеличение связано с разрешением, а бесполезное - нет. По существу бесполезное увеличение представляет собой масштабирование изображения, при котором объем полученной информации остается прежним или даже снижается. Тем не менее, оно может понадобиться, например, при согласовании размеров поля зрения микроскопа и ПЗС-матрицы цифрового фотоаппарата.
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и окуляра. В некоторых микроскопах следует учитывать также увеличение дополнительных линз, встроенных в бинокулярную насадку. В микроскопах, оборудованных телекамерами или цифровыми фотоаппаратами, к оптическому увеличению добавляется еще и электронное масштабирование. Поскольку общее увеличение микроскопа в этом случае будет зависеть от многих факторов, в научных публикациях вместо него принято указывать марку микроскопа, а также увеличение и апертуру используемого объектива (например, Zeiss Axiolab, x100/1.25).
Калибровка микроскопа . Если предполагается измерять размеры клеток и других микроструктур, микроскоп необходимо прокалибровать. Калибровка микроскопа производится с помощью специального препарата - объект-микрометра. Он представляет собой предметное стекло, в центре которого нанесена шкала с делениями ценой 10 мкм (рис. 4). Встречаются также объект-микрометры в виде металлической пластины с отверстием в центре, где укреплено стекло со светлой шкалой на темном фоне. Однако, они менее удобны из-за сложности фокусировки на шкалу, особенно при недостатке света на больших увеличениях.
Для определения размеров микрообъектов используется специальный измерительный окуляр (окуляр-микрометр),
в котором также имеется шкала. Принцип калибровки заключается в определении цены деления шкалы окуляр-микрометра путем совмещения ее со шкалой
объект-микрометра. Зная цену деления объект-микрометра и число его делений, приходящихся на определенное число делений окуляр-микрометра, можно, разделив первое на второе, получить калибровочный фактор
. Умножение калибровочного фактора на результаты измерений
окуляр-микрометром позволит приводить их к абсолютной величине, выраженной в микрометрах. Для повышения точности измерений применяются также усовершенствованные окуляр-микрометры, которые снабжены микрометрическим винтом, передвигающим указатель в поле зрения.
Если микроскоп имеет встроенную телекамеру или цифровой фотоаппарат, его калибровку проводят следующим образом:
1. Устанавливают объект-микрометр в микроскоп таким образом, чтобы его деления занимали строго вертикальное положение.
2. Фокусируют объектив на шкалу объект-микрометра и получают ее цифровой снимок (рис. 4).
3. С помощью программы обработки изображений Scion Image (или аналогичной) получают строго горизонтальный профиль яркости вдоль шкалы.
4. Измеряют число пикселов (элементов растра) в отрезке, соединяющем два достаточно далеко отстоящих друг от друга деления шкалы.
5. Вычисляют калибровочный фактор, разделив длину отрезка (мкм) на измеренное в нем число пикселов.
Рис. 4. Шкала объект-микрометра (слева) и ее профиль яркости (справа).
Объектив х10, цена деления 10 мкм. На шкале дополнительно показана линия профиля яркости. Расстояние между крайними делениями вдоль этой линии составляет 400 мкм или 265 пикселов. Калибровочный фактор равен 1.509 (400/265).
Этот способ калибровки микроскопа проводится быстро и обладает высокой точностью (ошибка менее 1%). Естественно, калибровка должна проводиться для каждого объектива отдельно, даже если они имеют одинаковое номинальное увеличение.
Измерение разрешающей способности микроскопа. Формула Рэлея-Аббе позволяет рассчитать только номинальное (т.е. теоретически ожидаемое) разрешение объектива. Действительное разрешение объектива (и микроскопа в целом) может значительно отличаться от номинального.
Если микроскоп оборудован телекамерой или цифровым фотоаппаратом, измерение его реальной разрешающей способности не представляет большой проблемы. Для этого, однако, необходимо более подробно рассмотреть принцип его работы.
Описанная выше диффракция Френеля в виде концентрических круглых колец (рис. 1) возникает только в том случае, если световая волна обладает полной когерентностью. Обладающая частичной когерентностью система освещения микроскопа будет формировать диффракционую картину без выраженных колец. Более того, из-за неидеальности оптики обратное преобразование Фурье также даст изображение, сглаженное по сравнению с исходным. Следовательно, микроскоп вносит погрешность в процесс формирования изображения, что приводит к снижению его разрешающей способности. Для оценки этой погрешности в микроскопии применяют функцию рассеяния точки (P oint S pread F unction, PSF ) и функцию оптической передачи (O ptical T ransfer F unction, OTF ).
Рис. 5. Функция рассеяния точки (PSF ) и функция оптической передачи (OTF ). OTF является Фурье-образом PSF.
По существу, PSF представляет собой наблюдаемое в микроскоп изображение круглого отверстия минимального диаметра, которое освещено некогерентным светом, а OTF является его Фурье-образом (рис. 5). Чем меньше PSF (и больше сопряженная с ним OTF), тем выше разрешение. Таким образом, задача измерения разрешающей способности микроскопа сводится к определению его PSF (или OTF).
Существует много различных способов прямой и косвенной оценки величины PSF. Например, ее можно вычислить, если исследовать форму перепадов яркости в окрестностях границ микрообъектов. На практике, однако, наиболее простым и точным способом оценки максимального разрешения микроскопа является анализ его OTF, а не PSF.
Для того чтобы измерить разрешающую способность микроскопа при данном увеличении по OTF, необходимо:
1. Получить цифровую фотографию цитологического препарата.
2. Чтобы была возможность применить быстрый алгоритм преобразования Фурье, вырезать из нее квадратный участок, сторона которого L (в пикселах) равна степени числа 2 (128,256,512 и т. д.).
3. Выполнить прямое преобразование Фурье этого участка с помощью программы Scion Image (или аналогичной) и получить OTF микроскопа.
4. Измерить диаметр OTF (D) в пикселах (рис. 5).
5. Используя полученные параметры L и D , а также размеры ячейки матрицы камеры C в мкм, увеличение адаптера камеры Ma иувеличение объектива Mo ,рассчитать максимальное разрешение микроскопа d в нм по формуле:
Рис. 6. Изображение анафазы митоза (256х256) и его Фурье-образ.
Цифровая фотография делящейся митозом клетки корешка лука (рис. 6, слева) снята при помощи микроскопа Zeiss Axiolab, объектив x100/1.25, камера Axiocam MR с адаптером x0.63, размер ячейки ПЗС-матрицы 6.7 мкм (указан в спецификации). Фурье-образ этого снимка (рис. 6, справа) получен в программе Scion Image после кадрирования рамкой 256х256. Измеренный с помощью программы Scion Image диаметр OTF составляет 129 пикселов, рассчитанное по приведенной формуле разрешение микроскопа - 211 нм.
Точность данного метода измерения разрешающей способности микроскопа зависит, главным образом, от корректности определения диаметра OTF. Однако, как видно из профиля яркости OTF (рис. 7), ее граница плавно снижается к уровню случайного шума, что затрудняет измерение D .
Один из способов повышения объективности определения диаметра OTF заключается в том, чтобы измерять его (или радиус OTF, который обозначается как HWHM ) на половине максимальной яркости сигнала. Оценка разрешения микроскопа при этом будет несколько ниже максимального значения.
Другой способ состоит в использовании специальных препаратов, приготовленных из диатомовых водорослей и содержащих мелкие регулярные структуры на пределе разрешения микроскопа. В этом случае в Фурье-образе появляются контрастные рефлексы, которые значительно облегчают точное измерение диаметра OTF.
Рис. 7. Профиль яркости OTF от центра к периферии. HWHM - радиус OTF на уровне половины ее максимума (H alf W idth on H alf M aximum).
PSF и OTF непосредственно связаны с формулой Рэлея-Аббе. В свободном от аберраций микроскопе PSF обладает круговой симметрией и определяется выражением
где h(r) – это PSF, J 1 - функция Бесселя первого рода, a = 2pNA/l.
Таким образом, по крайней мере, в идеальном случае форма PSF определяется только двумя параметрами - длиной волны l и численной апертурой объектива NA. Аналитическое описание PSF может использоваться для повышения разрешающей способности микроскопа путем дополнительной обработки изображений на компьютере.
Методические указания
Для изучения объектов имеющих малые размеры и неразличимых невооруженным глазом, используют специальные оптические приборы – микроскопы. В зависимости от назначения различают: упрощенные, рабочие, исследовательские и универсальные. По используемому источнику освещения микроскопы подразделяются на: световые, люминесцентные, ультрафиолетовые, электронные, нейтронные, сканирующие, тоннельные. Конструкция любого из перечисленных микроскопов включает механическую и оптическую части. Механическая часть служит для создания условий наблюдения – размещения объекта, фокусировки изображения, оптическая – получения увеличенного изображения.
Устройство светового микроскопа
Микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете в светлом поле зрения. На (рис.Внешний вид Биомед 2) представлен общий вид микроскопа Биомед-2.
|
|
Механическая часть микроскопа состоит из основания микроскопа, подвижного предметного столика и револьверного устройства.
Фокусировка на объект осуществляется перемещением предметного столика путем вращения ручек грубой и тонкой настройки.
Диапазон грубой фокусировки микроскопа – 40 мм.
Конденсор крепится на кронштейне и располагается между предметным столиком и коллекторной линзой. Его движение производиться вращением ручкой регулировки высоты конденсора. Общий вид его показан на (рис.???) Двухлинзовый конденсор с апертурой 1,25 обеспечивает освещение полей на объекте при работе с объективами увеличением от 4 до 100 крат.
Предметный столик укреплен на кронштейне. Координатное перемещение предметного столика, возможно, при вращении рукояток. Крепление объекта на столике осуществляется держателями препарата. Держатели можно перемещать относительно друг друга.
Координаты объекта и величина перемещения отсчитывается по шкалам с ценой деления 1 мм и нониусам с ценой деления 0,1 мм. Диапазон перемещения объекта в продольном направлении 60 мм, в поперечном направлении – 40 мм. Конденсор
Конденсор
Микроскоп оборудован узлом крепления конденсора с возможностью центрировочного и фокусировочного перемещения.
В качестве базового в микроскопе используется универсальный конденсор, установленный в держатель; при использовании иммерсионного масла - числовая апертура составляет 1,25.
При настройке освещения плавное изменение числовой апертуры пучка лучей освещающих препарат, осуществляется с помощью апертурной диафрагмы.
Конденсор устанавливается в держатель конденсора в фиксированное положение и закрепляется стопорным винтом.
Винты для центрировки конденсора используются в процессе настройки освещения для перемещения конденсора в плоскости, перпендикулярной к оптической оси микроскопа, при центрировке изображения полевой диафрагмы относительно краев поля зрения.
Рукоятка перемещения конденсора вверх-вниз, расположена на левой стороне кронштейна держателя конденсора, используются при настройке освещения для фокусирования на изображение полевой диафрагмы.
Светофильтры устанавливаются в поворотное кольцо, расположенное в нижней части конденсора.
Оптическая часть микроскопа
Состоит из осветительной и наблюдательной систем. Осветительная система равномерно освещает поля зрения. Наблюдательная система предназначена для увеличения изображения наблюдаемого объекта.
Осветительная система
Находится под предметным столиком. Она состоит из коллекторной линзы установленной в корпусе, которая ввинчивается в отверстие основания микроскопа и патрона с установленной в него лампой. Патрон с лампой установлен внутри основания микроскопа. Питание осветителя микроскопа обеспечивается от сети переменного тока через трех-контактый провод питания, подключаемый с помощью штекера к сети питания. Включение лампы осветителя осуществляется выключателем, расположенным на основании микроскопа.
Наблюдательная система
Состоит из объективов, монокулярной насадки и окуляров.
Объективы
Объективы составляют самую важную, наиболее ценную и хрупкую часть микроскопа. От них зависит увеличение, разрешающая способность и качество изображения. Они представляют собой систему взаимно центрированных линз, заключенных в металлическую оправу. На верхнем конце оправы имеется резьба, при помощи которой объектив крепится в гнезде револьвера. Передняя (ближайшая к объекту) линза в объективе называется фронтальной, единственная в объективе, производящая увеличение. Все остальные линзы объектива называются коррекционными и служат для устранения недостатков оптического изображения.
При прохождении через линзы пучка световых лучей с разной длиной волны возникает радужное окрашивание изображения – хроматическая аберрация. Неодинаковое преломление лучей на кривой поверхности линзы приводит к сферической аберрации, возникающей вследствие неравномерного преломления центральных и периферических лучей. В результате точечное изображение получается в виде размытого кружка.
Объективы, входящие в комплект микроскопа, рассчитаны на оптическую длину тубуса 160мм, высоту 45 мм и толщину покровного стекла препарата мм.
Объективы увеличением более 10X снабжены пружинящими оправами, предохраняющими от повреждения препарат и фронтальные линзы объективов при фокусировании на поверхность препарата.
На корпусе объектива в соответствии с увеличением может быть нанесено цветное кольцо, а также:
- числовая апертура;
- оптическая длина тубуса 160;
- толщина покровного стекла 0,17, 0 или －";
- вид иммерсии - масляная OIL (М.И.) или водная В.И.;
Объективы с маркировкой 0,17 рассчитаны для исследования препаратов только с покровными стеклами толщиной 0,17 мм. Объективы с маркировкой 0 рассчитаны для исследования препаратов только без покровных стекол. Объективы слабого увеличения (2,5 - 10), а также иммерсионные объективы могут быть использованы при исследовании препаратов как с покровным стеклом, так и без покровного стекла. Эти объективы маркируются значком －.
Окуляры
Окуляр микроскопа состоит из двух линз: глазной (верхней) и собирательной (нижней). Между линзами находится диафрагма. Боковые лучи диафрагма задерживает, близкие к оптической оси пропускает, что усиливает контрастность изображения. Назначение окуляра состоит в увеличении изображения, которое дает объектив. Окуляры имеют собственное увеличение ×5, ×10, ×12.5, ×16 и ×20, что указано на оправе.
Выбор окуляров зависит от комплекта применяемых объективов. При работе с объективами ахроматами, ахростигматами и ахрофлюарами целесообразно использовать окуляры с линейным полем зрения не более 20 мм, с объективами планахроматами и планапохроматами - окуляры с линейным полем зрения 20; 22 и 26,5 мм.
Дополнительно микроскоп может комплектоваться окуляром WF10/22 со шкалой; цена деления шкалы 0,1 мм.
Характеристики микроскопов
Увеличение микроскопа
К основным характеристикам микроскопа относятся увеличение и разрешающая способность. Общее увеличение, которое дает микроскоп, определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не характеризует качества изображения, оно может быть четким и нечетким. Четкость получаемого изображения характеризуется разрешающей способностью микроскопа, т.е. той наименьшей величиной объектов или их деталей, которые можно увидеть с помощью этого прибора.
Общее увеличение Г микроскопа при визуальном наблюдении определяется по формуле: Г = βок × βок, где:
βоб - увеличение объектива (маркируется на объективе); βок - увеличение окуляра (маркируется на окуляре).
Диаметр поля, наблюдаемого в объекте, Доб мм, определяется по формуле: Доб= Док × βоб. Док –диаметр окулярного поля зрения(маркируется на окуляре)мм. Расчетные значения увеличения микроскопа и диаметра наблюдаемого поля на объекте приведены в таблице 3.
| Увеличение объектива | Увеличение микроскопа и наблюдаемое поле
на объекте с окуляром: |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 5/26* | 10/22 | 15/16* | ||||
| Г | Доб, мм | Г | Доб, мм | Г | Доб, мм | |
| 4 | 20 | 4,0 | 50 | 4,5 | 64 | 3,75 |
| 10 | 50 | 2,0 | 100 | 1,8 | 160 | 1,5 |
| 20 | 100 | 1,0 | 200 | 0,9 | 320 | 0,75 |
| 40 | 200 | 0,5 | 420 | 0,45 | 640 | 0,38 |
| 100 | 500 | 0,2 | 1000 | 0,18 | 1600 | 0,15 |
- По дополнительному заказу
Разрешающая способность микроскопа
Разрешающая способность микроскопа определяется минимальным (разрешающим) расстоянием между двумя точками (или двумя тончайшими штрихами), видимыми раздельно, и вычисляется по формуле
D=λ/(A1+A2) , где d – минимальное (разрешающее) расстояние между двумя точками (штрихами); λ – длина волны ис- пользуемого света; A1 и А2 – числовая апертура объектива (обозначена на его оправе) и конденсора.
Увеличить разрешающую способность (т.е. уменьшить абсолютную величину d, так как это обратные величины) можно следующими путями: освещать объект светом с более короткой длиной волны λ (например, ультрафиолетовыми или коротковолновыми лучами), использовать объективы с большей апертурой А1 или повышать апертуру конденсора А2.
Рабочее расстояние объектива
Микроскопы снабжают четырьмя съемными объективами с собственными увеличениями 4×, 10×, 40× и 100×, обозначенными на металлической оправе. Увеличение объектива зависит от кривизны основной фронтальной линзы: чем больше кривизна, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение. Это необходимо помнить при микроскопировании – чем большее увеличение дает объектив, тем меньше свободное рабочее расстояние и тем ниже следует опускать его над плоскостью препарата.
Иммерсия
Все объективы разделяются на сухие и иммерсионные, или погружные. Сухим называется такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. Объективы сухой системы имеют обычно большое фокусное расстояние и дают малое (10×) или среднее (40×) увеличение.
Иммерсионными, или погружными, называют такие объективы, между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. В качестве иммерсионной среды используют обычно кедровое масло. Можно использовать также воду, глицерин, прозрачные масла, монобромнафталин и др. При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается однородная (гомогенная) среда (стекло препарата – масло – стекло объ- ектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия наилучшего освещения препарата. Величина (n) показателя преломления равна для воды 1,33, для кедрового масла 1,515, для монобромнафталина 1,6.
Техника микроскопирования
Микроскоп при помощи кабеля питания подключают к электрической сети. С помощью револьвера устанавливают в ход лучей объектив с увеличением ×10. Легкий упор и звук щелчка пружины револьвера свидетельствуют о том, что объектив установлен по оптической оси. Ручкой грубой фокусировки опускают объектив на расстояние 0,5 – 1,0 см от предметного столика.
Правила работы с сухими объективами.
Приготовленный препарат помещают на предметный столик и закрепляют зажимом. С помощью сухого объектива с увеличением ×10 просматривают несколько полей зрения. Передвигают предметный столик боковыми винтами. Нужный для исследования участок препарата устанавливают в центре поля зрения. Поднимают тубус и вращением револьвера переводят объектив с увеличением ×40, наблюдая сбоку, макрометрическим винтом снова опускают тубус с объективом почти до соприкосновения с препаратом. Смотрят в окуляр, очень медленно поднимают тубус до появления контуров изображения. Точную фокусировку производят с помощью микрометрического винта, вращая его в ту или другую сторону, но не более чем на один полный оборот. Если при вращении микрометрического винта чувствуется сопротивление, значит, ход его пройден до конца. В этом случае поворачивают винт на один-два полных оборота в обратную сторону, снова находят изображение при помощи макрометрического винта и переходят к работе с микрометрическим винтом.
Полезно приучить себя при микроскопировании держать оба глаза открытыми и пользоваться ими попеременно, так как при этом меньше утомляется зрение.
При смене объективов не следует забывать, что разрешающая способность микроскопа зависит от соотношения апертуры объектива и конденсора. Числовая апертура объектива с увеличением ×40 составляет 0,65, неиммергированного конденсора – 0,95. Привести их в соответствие практически можно следующим приемом: сфокусировав препарат с объективом, следует вынуть окуляр и, глядя в тубус, прикрывать ирисовую диафрагму конденсора до тех пор, пока ее края не станут видны у границы равномерно освещенной задней линзы объектива. В этот момент числовые апертуры конденсора и объектива будут примерно равны.
Правила работы с иммерсионным объективом.
На препарат (лучше фиксированный и окрашенный) наносят небольшую каплю иммерсионного масла. Поворачивают револьвер и устанавливают по центральной оптической оси иммерсионный объектив с увеличением 100×. Конденсор поднимают вверх до упора. Ирисовую диафрагму конденсора открывают полностью. Глядя сбоку, макрометрическим винтом опускают тубус до погружения объектива в масло, почти до соприкосновения линзы с предметным стеклом препарата. Это нужно проводить очень осторожно, чтобы фронтальная линза не сместилась и не получила повреждения. Смотрят в окуляр, очень медленно вращают макрометрический винт на себя и, не отрывая объектив от масла, приподнимают тубус до появления контуров объекта. При этом следует помнить, что свободное рабочее расстояние в иммерсионном объективе равно 0,1 – 0,15 мм. Затем точную фокусировку производят макрометрическим винтом. Рассматривают в препарате несколько полей зрения, передвигая столик боковыми винтами. По окончании работы с иммерсионным объективом поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой мягкой хлопчатобумажной салфеткой, затем той же салфеткой, но слегка смоченной чистым бензином. Оставлять масло на поверхности линзы нельзя, так как оно способствует оседанию пыли и может привести со временем к повреждению оптики микроскопа. Препарат освобождают от масла сначала кусочком фильтровальной бумаги, затем обрабатывают стекло бензином или ксилолом.
Увеличение системы – важный фактор, в основе которого лежит выбор того или другого микроскопа в зависимости от решения необходимых задач. Все мы привыкли к тому, что проводить контроль полупроводниковых элементов необходимо на инспекционном микроскопе с увеличением 1000 и более крат, изучать насекомых можно, работая с 50 кратным стереомикроскопом, а луковые чешуйки, окрашенные йодом или зеленкой, мы изучали в школе на монокулярном микроскопе, когда понятие увеличения еще не было нам знакомо.
Но как интерпретировать понятие увеличения, когда перед нами находится цифровой или конфокальный микроскоп, а на объективах стоят значения 2000х, 5000х? Что это означает, будет ли 1000 кратное увеличение на оптическом микроскопе давать изображение, аналогичное цифровому 1000 кратному микроскопу? Об этом вы узнаете в этой статье.
Оптическое увеличение системы
Когда мы работаем с лабораторным или стереоскопическим микроскопом, подсчет текущего увеличения системы не составляет труда. Необходимо перемножить увеличение всех оптических компонентов системы. Обычно, в случае стереомикроскопа это объектив, трансфокатор или увеличительный барабан и окуляры.
В случае обычного лабораторного микроскопа дело обстоит еще проще – общее увеличение системы = кратность окуляров умноженная на кратность объектива, установленного в рабочую позицию. Важно помнить, что иногда встречаются специфические модели тубусов микроскопа, имеющие увеличивающий или уменьшающий фактор (особенно распространено для старых моделей микроскопов Leitz). Также, дополнительные оптические компоненты, будь то источник коаксиального освещения в стереомикроскопе или промежуточный адаптер для камеры, располагающийся под тубусом, могут иметь дополнительный фактор увеличения.
Дополнительные оптические компоненты иногда имеют свой фактор увеличения, отличный от 1. В данном случае, коаксиальный осветитель (поз. 2) стереомикроскопа Olympus SZX16 имеет дополнительный увеличивающий фактор 1,5х. К примеру, стереомикроскоп с окулярами 10х, объективом 2х, трансфокатором в позиции 8х и блоком коаксиального освещения с фактором 1,5х будет обладать общим оптическим увеличением 10х2х8х1,5 = 240 крат.
Принципиальная схема получения изображения на световом микроскопе. Окуляр увеличивает изображение, построенное объективом и формирует мнимое изображение. Под оптическим увеличением (Г) в таком случае следует понимать отношение тангенса угла наклона луча, вышедшего из оптической системы в пространство изображений, к тангенсу угла сопряженного ему луча в пространстве предметов. Либо отношение длины, сформированного оптической системой изображения отрезка, перпендикулярного оси оптической системы, к длине самого отрезка
Геометрическое увеличение системы
В случае, когда у системы нет окуляров, а увеличенное изображение формируется камерой на экране монитора, к примеру, как на микроскопе , следует переходить к термину геометрического увеличения оптической системы.
Геометрическое увеличение микроскопа – отношение линейного размера изображения объекта на мониторе к реальному размеру изучаемого объекта.
Получить значение геометрического увеличения можно перемножив следующие величины: оптическое увеличение объектива, оптическое увеличение адаптера камеры, отношение диагонали монитора к диагонали матрицы камеры.
К примеру, при работе на лабораторном микроскопе с объективом 50х, адаптером камеры 0,5х, камерой 1/2.5” и, выводя изображение на монитор ноутбука 14”, мы получим геометрическое увеличение системы = 50х0,5х(14/0,4) = 875х.
Хотя оптическое увеличение при этом будет равно 500х в случае 10х окуляров.
Цифровые микроскопы, конфокальные профилометры, электронные микроскопы и другие системы, формирующие цифровое изображение объекта на экране монитора оперируют понятием геометрического увеличения. Не стоит путать это понятие с оптическим увеличением.
Разрешение микроскопа
Широко распространено заблуждение, что разрешение микроскопа и его увеличение связаны между собой жесткой связью – чем больше увеличение, тем более мелкие объекты мы сможем в него увидеть. Это не верно. Самым важным фактором всегда остается разрешение оптической системы. Ведь увеличение неразрешенного изображения не даст нам о нем новой информации.
Разрешение микроскопа зависит от числового значения апертуры объектива, а также от длины волны источника освещения. Как вы видите, параметра увеличения системы в этой формуле нет.
где λ – усредненная длина волны источника света, NA – числовая апертура объектива, R – разрешение оптической системы.
При использовании объектива с NA 0,95 на лабораторном микроскопе с галогенным источником (средняя длина волны порядка 500 нм) мы получаем разрешение около 300 нм.
Как видно из принципиальной схемы светового микроскопа, окуляры увеличивают действительное изображение объекта. Если, к примеру, повысить кратность увеличения окуляров в 2 раза (вставить в микроскоп окуляры 20х) – то общее увеличение системы удвоится, но разрешение при этом останется прежним.
Важное замечание
Предположим, что у нас есть два варианта построения простого лабораторного микроскопа. Первый построим, используя объектив 40х NA 0,65 и окуляры 10х. Второй же будет использовать объектив 20х NA 0,4 окуляры 20x.
Увеличение микроскопов в обоих вариантах будет одинаковое = 400х (простое перемножение увеличения объектива и окуляров). А вот разрешение в первом варианте будет выше, чем во втором, так как числовая апертура объектива 40х больше. К тому же не стоит забывать о поле зрения окуляров, у 20х этот параметр на 20-25% ниже.
2. Оптическая система микроскопа.
3. Увеличение микроскопа.
4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа.
5. Полезное увеличение микроскопа.
6. Специальные приемы микроскопии.
7. Основные понятия и формулы.
8. Задачи.
Способность глаза различать мелкие детали предмета зависит от размеров изображения на сетчатке или от угла зрения. Для увеличения угла зрения используют специальные оптические приборы.
25.1. Лупа
Простейшим оптическим прибором для увеличения угла зрения является лупа, представляющая собой короткофокусную собирающую линзу (f = 1-10 см).
Рассматриваемый предмет помещают между лупой и ее передним фокусом с таким расчетом, чтобы его мнимое изображение находилось в пределах аккомодации для данного глаза. Обычно используют плоскости дальней или ближней аккомодации. Последний случай предпочтительнее, так как глаз не утомляется (кольцевая мышца не напряжена).
Сравним углы зрения, под которыми виден предмет, рассматриваемый «невооруженным» нормальным глазом и с помощью лупы. Расчеты выполним для случая, когда мнимое изображение предмета получается на бесконечности (дальний предел аккомодации).
При рассматривании предмета невооруженным глазом (рис. 25.1, а) для получения максимального угла зрения предмет нужно поместить на расстояние наилучшего зрения а 0 . Угол зрения, под которым при этом виден предмет, равен β = В/а 0 (В - размер предмета).
При рассматривании предмета с помощью лупы (рис. 25.1, б) его помещают в передней фокальной плоскости лупы. При этом глаз видит мнимое изображение предмета В", расположенное в бесконечно удаленной плоскости. Угол зрения, под которым видно изображение, равен β" ≈ В/f.
Рис. 25.1. Углы зрения: а - невооруженным глазом; б - с помощью лупы: f - фокусное расстояние лупы; N - узловая точка глаза
Увеличение лупы - отношение угла зрения β", под которым видно изображение предмета в лупе, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» нормальным глазом с расстояния наилучшего зрения:
Увеличения лупы для близорукого и дальнозоркого глаза разные, так как у них различны расстояния наилучшего зрения.
Приведем без вывода формулу для увеличения, которое дает лупа, используемая близоруким или дальнозорким глазом при формировании изображения в плоскости дальней аккомодации:
где а даль - дальний предел аккомодации.
Формула (25.1) позволяет предположить, что, уменьшая фокусное расстояние лупы, можно добиться сколь угодно большого увеличения. В принципе это так. Однако при уменьшении фокусного расстояния лупы и сохранении ее размеров возникают такие аберрации, которые сводят на нет весь эффект увеличения. Поэтому однолинзовые лупы обычно имеют 5-7-кратное увеличение.
Для уменьшения аберраций изготавливают сложные лупы, состоящие из двух-трех линз. В этом случае удается добиться 50-кратного увеличения.
25.2. Оптическая система микроскопа
Большее увеличение можно осуществить, рассматривая при помощи лупы действительное изображение предмета, создаваемое другой линзой или системой линз. Такое оптическое устройство реализовано в микроскопе. Лупу в этом случае называют окуляром, а другую линзу - объективом. Ход лучей в микроскопе показан на рис. 25.2.
Предмет В помещается вблизи переднего фокуса объектива (F об) с таким расчетом, чтобы его действительное, увеличенное изображение B" находилось между окуляром и его передним фокусом. При
Рис. 25.2.
Ход лучей в микроскопе.
этом окуляр дает мнимое увеличенное изображение B", которое и рассматривает глаз.
Изменяя расстояние между предметом и объективом, добиваются того, чтобы изображение В" оказалось в плоскости дальней аккомодации глаза (в этом случае глаз не утомляется). Для человека с нормальным зрением В" располагается в фокальной плоскости окуляра, а В" получается на бесконечности.
25.3. Увеличение микроскопа
Основной характеристикой микроскопа является его угловое увеличение. Это понятие аналогично угловому увеличению лупы.
Увеличение микроскопа - отношение угла зрения β", под которым видно изображение предмета в окуляре, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» глазом с расстояния наилучшего зрения (а 0):
25.4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа
Может сложиться впечатление, что, увеличивая оптическую длину тубуса, можно добиться сколь угодно большого увеличения и, следовательно, рассмотреть самые мелкие детали предмета.
Однако учет волновых свойств света показывает, что на размеры мелких деталей, различимых с помощью микроскопа, накладываются ограничения, связанные с дифракцией света, проходящего через отверстие объектива. Вследствие дифракции изображением освещенной точки оказывается не точка, а небольшой светлый кружок. Если рассматриваемые детали (точки) предмета расположены достаточно далеко, то объектив даст их изображения в виде двух отдельных кружков и их можно различить (рис. 25.3, а). Наименьшему расстоянию между различимыми точками соответствует «касание» кружков (рис. 25.3, б). Если точки расположены очень близко, то соответствующие им «кружки» перекрываются и воспринимаются как один объект (рис. 25.3, в).
Рис. 25.3.
Разрешающая способность
Основной характеристикой, показывающей возможности микроскопа в этом отношении, является предел разрешения.
Предел разрешения микроскопа (Z) - наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они различимы как отдельные объекты (т.е. воспринимаются в микроскопе как две точки).
Величина, обратная пределу разрешения, называется разрешающей способностью. Чем меньше предел разрешения, тем больше разрешающая способность.
Теоретический предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света, используемого для освещения, и от угловой апертуры объектива.
Угловая апертура (u) - угол между крайними лучами светового пучка, входящего в линзу объектива от предмета.
Укажем без вывода формулу для предела разрешения микроскопа в воздушной среде:
где λ - длина волны света, которым освещается объект.
У современных микроскопов угловая апертура достигает 140°. Если принять λ = 0,555 мкм, то получим для предела разрешения значение Z = 0,3 мкм.
25.5. Полезное увеличение микроскопа
Выясним, насколько большим должно быть увеличение микроскопа при заданном пределе разрешения его объектива. Примем во внимание, что у глаза имеется собственный предел разрешения, обусловленный строением сетчатки. В лекции 24 мы получили следующую оценку для предела разрешения глаза: Z ГЛ = 145-290 мкм. Для того чтобы глаз мог различить те же точки, которые разделяет микроскоп, необходимо увеличение
Это увеличение называют полезным увеличением.
Отметим, что при использовании микроскопа для фотографирования объекта в формуле (25.4) вместо Z ГЛ следует использовать предел разрешения пленки Z ПЛ.
Полезное увеличение микроскопа - увеличение, при котором предмет, имеющий размер, равный пределу разрешения микроскопа, имеет изображение, размер которого равен пределу разрешения глаза.
Используя полученную выше оценку для предела разрешения микроскопа Z м ≈0,3 мкм), найдем: Г п ~500-1000.
Добиваться большего значения для увеличения микроскопа не имеет смысла, так как никаких дополнительных деталей увидеть все равно не удастся.
Полезное увеличение микроскопа - это разумное сочетание разрешающих способностей и микроскопа, и глаза.
25.6. Специальные приемы микроскопии
Специальные приемы микроскопии используются для увеличения разрешающей способности (уменьшения предела разрешения) микроскопа.
1. Иммерсия. В некоторых микроскопах для уменьшения предела разрешения пространство между объективом и предметом заполняют специальной жидкостью - иммерсией. Такой микроскоп называют иммерсионным. Эффект иммерсии заключается в уменьшении длины волны: λ = λ 0 /n, где λ 0 - длина световой волны в вакууме, а n - показатель преломления иммерсии. В этом случае предел разрешения микроскопа определяется следующей формулой (обобщение формулы (25.3)):
Отметим,
что для иммерсионных микроскопов создают специальные объективы, так как
в жидкой среде изменяется фокусное расстояние объектива.
2. УФ-микроскопия. Для уменьшения предела разрешения используют коротковолновое ультрафиолетовое излучение, невидимое глазом. В ультрафиолетовых микроскопах микрообъект исследуется в УФлучах (в этом случае линзы выполняются из кварцевого стекла, а регистрация ведется на фотопленке или на специальном люминесцентном экране).
3. Измерение размеров микроскопических объектов. С помощью микроскопа можно определить размеры наблюдаемого объекта. Для этого применяют окулярный микрометр. Простейший окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения, получаемого от объектива. При рассматривании в окуляр изображения объекта и шкалы сливаются, можно отсчитать, какое расстояние по шкале соответствует измеряемой величине. Предварительно определяют по известному объекту цену деления окулярного микрометра.
4. Микропроекция и микрофотография. С помощью микроскопа можно не только наблюдать объект через окуляр, но и фотографировать его или проецировать на экран. В этом случае применяют специальные окуляры, которые и проецируют промежуточное изображение A"B" на пленку или на экран.
5. Ультрамикроскопия. Микроскоп позволяет обнаружить частицы, размеры которых лежат за пределами его разрешения. Этот метод использует косое освещение, благодаря чему микрочастицы видны как светлые точки на темном фоне, при этом строение частиц увидеть нельзя, можно только установить факт их наличия.
Теория показывает, что, как бы силен не был микроскоп, всякий предмет размерами меньше 3 мкм будет представляться в нем просто как одна точка, без всяких подробностей. Но это не означает, что такие частицы нельзя видеть, следить за их движениями или считать их.
Для наблюдения частиц, размеры которых меньше предела разрешения микроскопа, служит приспособление, называемое ультрамикроскоп. Главную часть ультрамикроскопа составляет сильное осветительное приспособление; освещенные таким образом частицы наблюдаются в обыкновенном микроскопе. Ультрамикроскопия основана на том, что мелкие частицы, взвешенные в жидкости или газе, делаются видимыми при сильном боковом освещении (вспомним пылинки, видимые в солнечном луче).
25.8. Основные понятия и формулы
Окончание таблицы
25.8. Задачи
1. Линза с фокусным расстоянием 0,8 см используется в качестве объектива микроскопа с фокусным расстоянием окуляра, равным 2 см. Оптическая длина тубуса равна 18 см. Каково увеличение микроскопа?
2.
Определить предел разрешения сухого и иммерсионного (n = 1,55) объективов c угловой апертурой u = 140 о. Длину волны принять равной 0,555 мкм.
3.
Чему равен предел разрешения на длине волны λ
= 0,555 мкм, если числовая апертура равна: А 1 = 0,25, А 2 = 0,65?
4.
С
каким показателем преломления следует взять иммерсионную жидкость,
чтобы рассмотреть в микроскопе субклеточный элемент диаметром 0,25 мкм
при наблюдении через оранжевый светофильтр (длина волны 600 нм)?
Апертурный угол микроскопа 70°.
5.
На ободке лупы имеется надпись «х10» Определить фокусное расстояние этой лупы.
6.
Фокусное расстояние объектива микроскопа f 1 = 0,3 см, длина тубуса Δ
= 15 см, увеличение Г = 2500. Найти фокусное расстояние F 2 окуляра. Расстояние наилучшего зрения a 0 = 25 см.